基因芯片原理和优势

2019-08-05 9:58

首先使固相片基羟基化，并用光敏保护基团将其保护起来，然后选取适当的避光膜 （mask）使需要聚合的部位透光，其他部位不透光。这样，当光通过避光膜照射到支持物 上时，受光部位的羟基就会发生脱保护而活化，从而可以反应结合碱基。由于参与合成的 碱基单体一端可以进行固相合成，另一端受光敏基团的保护，所以原位合成后，可进行下 一轮的光照、脱保护和固相合成。循环下去，不断改变避光膜的透光位点，就可以实现在 同一玻片上合成成千上万种预定序列的寡核苷酸探针。

GeneChip独特的PM-MM探针设计

基因芯片杂交的灵敏度和特异性是芯片技术的核心，Affymetrix在探讨了各种各样的影响 因素后，设计出了一种独特的PM-MM探针方案（见下图）。芯片上的每一个基因或EST都 是由一个或几个探针组(probeset)组成，每组探针组又由11-20对25mer的探针对(probe pair)组成，每探针对包括两个探针池(probecell)，其中一个是完全匹配（Perfect- Match，PM）的，另外一个是序列中间有一个碱基错配的(Mis-match,MM)。

独特的PM-MM探针设计的优势

1特异性好 2灵敏度高 3定量精确、重复性好 4提供样品质控 5特异性的提高

相比cDNA芯片和单一序列的寡核苷酸芯片，Affymetrix设计多个短的探针片段，可以有 效的区分有同源性的基因序列，克服了背景噪声、错误和偏差，避免了同源性靶序列与探 针交叉杂交，而引起的假阳性和判断错误。25mer长度的寡核苷酸的信号强度和分辨率达 到了一个平衡，在这个长度下，有一个碱基发生错配，杂交复合物就会变得很不稳定。如 果长度达到60mer，就无法区分序列上十分接近的序列了。此外,从多个探针位点检测的 荧光信号，经过综合评估、统计计算和分析，获得的数据比单个探针判断样品是否存在某 一靶序列的数据更为可靠。

灵敏度的提高

在PM-MM探针设计中，MM探针是有效的内参照，它们与PM探针一样可以和非特异性序列 结合，这样，就可以将不同来源的样品中的背景信号有效的定量扣除。这种独特的设计对 于区分特异性和非特异性杂交是相当灵敏的。比较那些单一的基因探针来说，PM-MM探针 的高特异性和灵敏度更适合检测低丰度表达的基因。如下图，仅用PM探针与联合应用PM- MM探针检测靶序列的灵敏度比较

如上图所示，将已克隆的转录产物以不同的浓度掺入到组织样品中，在组织样品中是 不含有原始的克隆转录产物的。经过标记的样品与AffymetrixGenechip人类基因组芯片 杂交，在克隆转录产物浓度低于8pM时，PM单独探针无法探测出相应的浓度变化，而与MM 探针联合使用则可以探测出。PM-MM探针对的使用可以探测出的样品中转录物的范围为 1:100,000-1:300,000。PM-MM探针对照设计可提高对复杂背景特异性检测，使得灵敏度与 特异性之间达到一个优化的平衡。

定量精确、重复性好

Affymetrix的基因芯片好的重复性使得某一样品中基因表达的绝对水平是可靠的，还使 得比较不同样品之间各种基因表达的相对比例是可靠的，而双色法需在每次杂交检测中设 置对照，只能进行两个样品之间的比较，芯片之间的比较并不可靠。Affymetrix进行多个 样品之间的比较时，只需在多个样本中设置对照即可。